Dr Mark Young

(e/fe)

Cyhoeddiad

• Date
• Type

Ymchwil

Cyflwyniad

Mae derbynyddion P2X yn sianeli ïon ATP-gratio sy'n chwarae rolau allweddol mewn amrywiaeth o brosesau ffisiolegol fel trosglwyddo synaptig, teimlad blas a rheolaeth cyhyrau llyfn.  Maent yn gweithredu mewn celloedd fel trimers, gyda dau barth trawsbilen fesul monomer a pharthau allgellog glycosylated mawr, glycosylated [1]. Cyhoeddwyd sawl strwythur crisial o dderbynyddion P2X yn ddiweddar (gan gynnwys rhai pysgod sebra P2X4 yn y cyflwr apo- ac ATP [2]), gan drawsnewid ein dealltwriaeth o'u perthynas strwythur-swyddogaeth [3], ond mae angen mwy o strwythurau, yn enwedig o'r isdeipiau dynol, ac mae hyn yn her sylweddol oherwydd mae'n anodd mynegi a phuro proteinau bilen ewcaryotig yn y symiau mawr sy'n ofynnol ar gyfer astudiaeth strwythurol.

Mae derbynyddion P2X hefyd yn ymwneud â llid. Mynegir isdeip derbynnydd P2X7 mewn celloedd imiwnedd; ac yn y llygod cyw allan yn brin P2X7, diddymwyd poen llidiol cronig, tra bod ymatebion poen acíwt yn aros yn ddigyfnewid [4]. Mae P2X7 yn unigryw ymhlith derbynyddion P2X gan fod ei actifadu yn arwain at ryddhau cytocinau pro-llidiol, ac mae actifadu hir yn achosi marwolaeth celloedd [5]. Mae priodweddau P2X7 yn cael eu rheoleiddio gan ei barth C-derfynell fewngellog hir, sy'n cyplu actifadu sianel ïon i signalau i lawr yr afon, ac awgrymwyd yn ddiweddar y gallai targedu signalau i lawr yr afon P2X7 gyfryngu fod yn strategaeth dda i ddatblygu cyffuriau gwrthlidiol mwy dethol [6].

Nodau

Archwilio mynegiant derbynyddion P2X mewn systemau ewcaryotig eraill

Rydym wedi mynegi derbynyddion P2X yn llwyddiannus mewn celloedd pryfed sydd wedi'u heintio â baculofirws [7] (ar y cyd â Dr Mark Parker, Case Western, UDA). Defnyddiwyd mynegiant celloedd pryfed yn llwyddiannus wrth ddatrys strwythur pysgod sebra P2X4 [2], felly mae'n cynrychioli system brofedig ar gyfer mynegi derbynyddion P2X. Rydym yn datblygu'r pryf ffrwythau Drosophila melanogaster fel system mynegiant ar gyfer proteinau bilen sy'n caniatáu astudiaethau strwythurol a swyddogaethol (ar y cyd â Dr Wynand Van der Goes Van Naters, Ysgol y Biowyddorau). Yn ddiweddar rydym hefyd wedi datblygu cydweithrediad â Dr Simon Scofield (Ysgol y Biowyddorau) i ddatblygu systemau mynegiant planhigion ar gyfer derbynyddion P2X.

P2X7 llwybrau signalau i lawr yr afon

Ar ôl actifadu gan ATP allgellog, cyplau P2X7 trwy ei barth C-derfynell hir i sawl llwybr signalau mewngellol, gan arwain at recriwtio llid NRLP3 a rhyddhau cytocinau pro-llidiol [5]. Mae gan y signalau hyn ganlyniadau pwysig mewn poen a llid, yn enwedig mewn cyflyrau llid cronig fel arthritis, clefyd Alzheimer a dirywiad macwlaidd sy'n gysylltiedig ag oedran (AMD). Mewn cydweithrediad â'r Athro Jayakrishna Ambati (Prifysgol Virginia, UDA), roeddem yn gallu dangos bod tarfu ar signalau P2X7 gyda modulator moleciwl bach wedi diddymu marwolaeth celloedd epithelial pigment retinol a welir yn AMD, gan gynnig gobaith y gallai P2X7 fod yn darged ar gyfer y clefyd anwelladwy hwn [8]. Er bod llawer o gydrannau i lawr yr afon o'r llwybrau signalau wedi'u nodweddu, nid yw sail moleciwlaidd y cam cyntaf yn y broses hon yn hysbys o hyd. Pa broteinau mae'r parth P2X7 C-terminal yn rhyngweithio â nhw, a sut mae'r rhyngweithiadau hyn yn cael eu rheoleiddio?

Dylunio cyffuriau sy'n seiliedig ar strwythur gan ddefnyddio modelau moleciwlaidd o dderbynyddion P2X dynol

Er nad oes gennym strwythurau cydraniad uchel ar gyfer naill ai P2X4 dynol neu P2X7 dynol, rydym wedi adeiladu modelau moleciwlaidd yn seiliedig ar strwythur crisial ATP pysgod zebrafish P2X4 [2] a strwythur cryoEM o llygoden fawr P2X7 [9]. Mewn cydweithrediad â Dr Andrea Brancale (Ysgol Fferylliaeth) rydym wedi defnyddio'r modelau moleciwlaidd hyn i berfformio mewn docio silico o ystod o gyfansoddion tebyg i gyffuriau i safle rhwymo ATP, gan ddewis y rhai sy'n rhoi'r ffit orau ar gyfer profion swyddogaethol gan ddefnyddio cymeriant calsiwm ac electroffisioleg. Yn y modd hwn rydym yn gobeithio darganfod cyfansoddion 'daro' sy'n modiwleiddio swyddogaeth derbynnydd P2X, y gellir eu haddasu ymhellach wedyn i ddatblygu cyffuriau cryf a detholus, a allai fod o fudd therapiwtig sylweddol mewn cyflyrau poen a llid.

Technoleg protein

Fel rhan o'r Ganolfan Technoleg Protein, rwy'n gweithio gyda Mikota PLC i ddatblygu puro a phrofi'r gweithdrefnau ar gyfer haemocyanin limped llithrig a collagen. Mae limpedi llithrig yn rhywogaeth ymledol yn y DU sy'n dinistrio cynefinoedd morol; Byddai dod o hyd i ddefnydd masnachol ar eu cyfer yn cymell eu symud a chynorthwyo adferiad ecosystemau (http://www.cardiff.ac.uk/news/view/987729-life-saving-limpets). Rwyf hefyd yn cydweithio â'r Athro Kenneth Harris (Ysgol Cemeg) gan ddefnyddio diffreithiant pelydr-X powdr ar gyfer astudiaeth strwythurol moleciwlau sy'n berthnasol yn fiolegol.

1. Grimes L and Young MT (2015) Derbynyddion P2X Purinergig: nodweddion strwythurol a swyddogaethol a ddarlunnir gan belydr-X ac astudiaethau modelu moleciwlaidd. Curr Med Chem 22, 783-98.
2. Hattori M and Gouaux E (2012) Mecanwaith moleciwlaidd o ATP rhwymo ac actifadu sianel ïonau mewn derbynyddion P2X. Natur 485, 207-212
3. Pasqualetto G et al. (2018) Mae'r penderfynyddion moleciwlaidd o ligand moleciwl-bach rhwymo ar dderbynyddion P2X. Ffiniau mewn Ffarmacoleg 9, 58. 
4. Chessell IP et al. (2005) Mae tarfu ar y genyn purinoceptor P2X7 yn cael gwared â phoen llidiol cronig a niwropathig. Poen 114, 386-396
5. Sluyter R (2017) Derbynnydd P2X7. Adv Exp Med Biol. doi: 10.1007 / 5584_2017_59
6. Mae Sorge RE et al. (2012) a benderfynir yn enetig P2X7 yn rheoleiddio amrywioldeb mewn sensitifrwydd poen cronig. Nat Med 18, 595-599
7. Valente M et al. (2011) Mynegiant, puro, microsgopeg electron, mutagenesis N-glycosylation a modelu moleciwlaidd P2X4 dynol a Disgoideum Dictyostelium P2XA. Bioffioedd Acta 1808, 2859-2866
8. Fowler BJ et al. (2014) Mae gan atalyddion trawsgrifiadau gwrthdroi niwcleosid weithgaredd gwrthlidiol cynhenid. Gwyddoniaeth 346, 1000-1003
9. Mae strwythurau McCarthy AE et al. (2019) hyd llawn P2X₇ yn datgelu sut mae Palmitoylation yn atal dadsensiteiddio sianel. Cell 2019 Hyd 17; 179(3): 659-670

Cydweithredwyr presennol

Prifysgol Caerdydd

• Dr Wynand van der Goes Van Naters
• Dr Colin Berry
• Dr Pierre Rizkallah
• Yr Athro Kenneth Harris

Mikota PLC

• Alex Mühlhölzl

Myfyrwyr ymchwil ôl-raddedig

• Miss Marika Zuanon
• Mr Ryan Coates

Addysgu

I teach in the Biochemistry/Protein Engineering subject areas in Years 2, 3 and 4. Subject areas include quantitative biochemistry, protein structure determination, protein purification, protein detection, enzyme regulation, structure-based drug design, membrane protein structure and synthetic biology chassis organisms.

I offer research projects in Years 3 and 4 looking at the structure-function relationship of plasma membrane ion channels and their roles in heath and disease.

I also teach Biochemistry and Exercise Physiology in the Platform for Clinical Science (Medical School).

Bywgraffiad

Meysydd goruchwyliaeth

Prosiect PhD ar gael:

Sut mae activation derbynnydd P2X7 yn cyfateb i signalau i lawr yr afon?

Mae derbynyddion P2X7 yn sianeli ïonau a geir ar wyneb celloedd imiwnedd, lle maent yn ymateb i rwymo ATP allgellog, signal difrod a ryddhawyd gan gelloedd sy'n marw mewn haint ac anaf. Mae rhwymo ATP i dderbynyddion P2X7 yn arwain at fewnlifiad calsiwm ac yn cychwyn rhaeadr signalau i lawr yr afon, gan arwain at ffurfio pores fawr yn y bilen plasma, newidiadau mewn siâp celloedd, secretiad protein, actifadu kinase a newidiadau mewn mynegiant genynnau. Mae swyddogaeth sianel ïon a signalau i lawr yr afon yn cael eu rheoleiddio'n uchel gan barthau mewngellol C-terminal 30 amino-asid a 240 amino-asid C-terminal y derbynnydd (NTD a CTD), yn rhannol o leiaf trwy ryngweithio â lipidau yn y bilen plasma, ond ychydig iawn a wyddom am eu rhyngweithio â biomoleciwlau eraill, neu pa rannau ohonynt sy'n ymwneud â llwybrau signalau. Mae cyhoeddiad diweddar strwythur cryoEM o rat hyd llawn P2X7 yn dangos bod y NTD a'r gyfran N-derfynell gyfoethog cystein o'r CTD (angor C-Cys) wedi'u palmitoylated, gan angori'r parthau hyn i daflen fewnol y bilen plasma, a bod cyfran C-derfynell y CTD (balast) yn ffurfio parth globular sy'n cynnwys safleoedd rhwymo ar gyfer sinc diniwclear a CMC / GTP, codi cwestiynau diddorol am ei swyddogaeth bosibl.

Ffocws y prosiect hwn fydd deall rôl parthau mewngellol P2X7 mewn signalau i lawr yr afon, gan ddefnyddio cyfuniad o fodelu moleciwlaidd, mutagenesis a gyfeiriwyd ar y safle, mynegiant protein, puro protein a phrofion swyddogaethol. Rhoddir ffocws penodol ar ddeall rôl lipidau wrth reoleiddio swyddogaeth derbynyddion, a rôl y parth balast wrth gyplysu rhaeadrau signalau mewngellog. Byddwn hefyd yn ceisio mynegi a phuro derbynyddion P2X7 hyd llawn (neu eu parthau mewngellol) ar gyfer astudiaeth strwythur 3D gan ddefnyddio crisialograffeg cryoEM neu belydr-X.