Dr Mark Young

(e/fe)

Cyhoeddiad

• Date
• Type

Ymchwil

Cyflwyniad

Mae derbynyddion P2X yn sianeli ïonau ATP-gated sy'n chwarae rolau allweddol mewn amrywiaeth o brosesau ffisiolegol fel trosglwyddo synaptig, teimlad blas a rheoli cyhyrau llyfn.  Maent yn gweithredu mewn celloedd fel trimers, gyda dau barth trawsbilen fesul monomer a pharhau allgellog mawr, glycosylated [1]. Mae sawl strwythur crisial a cryoEM o dderbynyddion P2X bellach ar gael (gan gynnwys rhai P2X7 llygod mawr yn y cyflwr apo- ac ATP-rhwymo [2]), gan drawsnewid ein dealltwriaeth o'u perthynas strwythur-swyddogaeth [3], a'n galluogi i ddefnyddio dulliau sy'n seiliedig ar strwythur i ddarganfod a modelu rhwymo modiwlyddion moleciwl bach newydd [4,5], fel cyffuriau posibl i drin clefyd llidus. 

Mae derbynyddion P2X hefyd yn ymwneud â llid. Mae'r is-deip derbynnydd P2X7 yn cael ei fynegi mewn celloedd imiwnedd; ac mewn llygod knock-out heb P2X7, diddymwyd poen llidiol cronig, tra bod ymatebion poen acíwt yn aros yn ddigyfnewid [6]. Mae P2X7 yn unigryw ymhlith y derbynyddion P2X gan fod ei actifadu yn arwain at ryddhau cytocinau pro-lidiol, ac mae actifadu hir yn achosi marwolaeth celloedd [7]. Mae priodweddau P2X7 yn cael eu rheoleiddio gan ei barth 'balast' C-terfynol mewngellog 200 asid amino, y credir ei fod yn cyplu actifadu sianel ïonau i signalau i lawr yr afon [2], ac awgrymwyd y gallai targedu signalau i lawr yr afon wedi'u cyfryngu gan P2X7 gynrychioli strategaeth dda i ddatblygu cyffuriau gwrthlidiol mwy detholus [8].

Nodau

Sut mae actifadu P2X7 yn paru â llwybrau signalau i lawr yr afon?

Ar ôl ei actifadu gan ATP allgellog, mae P2X7 yn cyplu trwy ei barth balast C-terfynol hir i sawl llwybr signalau mewngellog, gan arwain at recriwtio'r llid NRLP3 a rhyddhau cytocinau pro-llidiol [7]. Mae gan y signalau hyn ganlyniadau pwysig mewn poen a llid, yn enwedig mewn cyflyrau llid cronig fel arthritis, clefyd Alzheimer a dirywiad macwlaidd sy'n gysylltiedig ag oedran (AMD). Ar hyn o bryd rydym yn archwilio rôl y parth balast mewn signalau sy'n ddibynnol ar P2X7, gan ddefnyddio cyfuniad o fioleg celloedd, profion biocemegol a dulliau cyfrifiadurol (cydweithrediad â Dr Georgina Menzies, Caerdydd).

Dylunio cyffuriau sy'n seiliedig ar strwythur gan ddefnyddio modelau moleciwlaidd o dderbynyddion P2X dynol

Rydym wedi adeiladu modelau moleciwlaidd o dderbynyddion P2X dynol ac wedi defnyddio'r modelau moleciwlaidd hyn i berfformio in silico docio ystod o gyfansoddion tebyg i gyffuriau i'r safle rhwymo ATP, gan ddewis y rhai sy'n rhoi'r gorau ar gyfer profion swyddogaethol gan ddefnyddio amsugno calsiwm ac electroffisioleg (cydweithrediad â'r Athro Andrea Brancale). Yn y modd hwn rydym wedi darganfod cyfansoddion newydd sy'n modiwleiddio P2X7 [5] ac wedi ymchwilio i'r penderfyniadau o rwymo ligand yn P2X4 [4]. Rydym yn gobeithio datblygu'r gwaith hwn i ddod o hyd i gyfansoddion sydd wedyn yn cael eu haddasu ymhellach i ddatblygu cyffuriau cryf a detholus, a allai fod o fudd therapiwtig sylweddol mewn cyflyrau poen a llid.

Strwythur a dynameg hemocyanin limpet sliper

Fel rhan o'r Hwb Technoleg Protein, rwyf wedi gweithio gyda Mikota PLC i ymchwilio i strwythur 3D hemocyanin limpet sliper (protein cludwr ocsigen yn y gwaed) gan ddefnyddio cryoEM [10]. Mae limpets sliper yn rhywogaeth ymledol yn y DU sy'n dinistrio cynefinoedd morol; Byddai dod o hyd i ddefnydd masnachol ar eu cyfer yn ysgogi eu tynnu ac yn cynorthwyo adferiad ecosystemau (http://www.cardiff.ac.uk/news/view/987729-life-saving-limpets). Mae gennym ddiddordeb hefyd yn sut mae ocsigen yn rhwymo i hemocyanin, ac rydym yn ymchwilio i hyn gan ddefnyddio efelychiadau dynameg moleciwlaidd (cydweithrediad â Dr Georgina Menzies)

Cyfeirnodau

1. Grimes L a Young MT (2015) Derbynyddion P2X Purinergig: nodweddion strwythurol a swyddogaethol a ddarlunnir gan astudiaethau modelu pelydr-X a Moleciwlaidd. Curr Med Chem 22, 783-98.
2. McCarthy AE, Yoshioka C a Mansoor SE (2019) Mae strwythurau P2X₇ hyd llawn yn datgelu sut mae palmitoylation yn atal desensitization sianel. Cell 179, 659-70.
3. Pasqualetto G et al. (2018) Penderfynyddion moleciwlaidd rhwymo ligand moleciwl bach mewn derbynyddion P2X. Ffiniau mewn Ffarmacoleg 9, 58.
4. Pasqualetto G et al. (2023) Adnabod penderfynyddion moleciwlaidd nerth antagonist ym mhoced rhwymo allosterig P2X4 dynol. Front Pharmacol 14, 1101023.
5. Pasqualetto G et al. (2023) Adnabod gwrthwynebydd P2X7 newydd gan ddefnyddio sgrinio rhithwir sy'n seiliedig ar strwythur. Front Pharmacol 13, 1094607.
6. Chessell IP et al. (2005) Mae tarfu ar y genyn purinoceptor P2X7 yn diddymu poen llidiol a niwropathig cronig. Poen 114, 386-396
7. Sluyter R (2017) Y Derbynnydd P2X7. Adv Exp Med Biol. doi: 10.1007/5584_2017_59
8. Sorge RE et al. (2012) Mae ffurfiant mandyllau derbynnydd P2X7 a bennir yn enetig yn rheoleiddio amrywioldeb mewn sensitifrwydd poen cronig. Nat Med 18, 595-599
9. Fowler BJ et al. (2014) Mae gan atalyddion trawsgrifiad gwrthdro niwcleosid weithgaredd gwrthlidiol cynhenid. Gwyddoniaeth 346, 1000-1003
10. Pasqualetto G et al (2023) Strwythur CryoEM a modelu moleciwlaidd Alphafold o hemocyanin molysgaidd newydd. PLoS Un. 18 (6): e0287294.

Prifysgol Caerdydd

• Dr Georgina Menzies
• Yr Athro Kenneth Harris

Mikota PLC

• Alex Mühlhölzl

Myfyrwyr ymchwil ôl-raddedig

• Lloyd Allen
• Christopher Slack

Addysgu

I teach in the Biochemistry/Protein Engineering subject areas in Years 2, 3 and 4. Subject areas include quantitative biochemistry, protein structure determination, protein purification, protein detection, enzyme regulation, structure-based drug design, membrane protein structure and synthetic biology chassis organisms.

I offer research projects in Years 3 and 4 looking at the structure-function relationship of plasma membrane ion channels and their roles in heath and disease.

I also teach Biochemistry and Exercise Physiology in the Platform for Clinical Science (Medical School).

Bywgraffiad

Meysydd goruchwyliaeth

Prosiectau PhD sydd ar gael:

1. Ymchwilio i rôl parthau mewngellog derbynnydd P2X7 mewn signalau celloedd

Mae derbynyddion P2X7 yn sianeli ïonau sydd i'w cael ar wyneb celloedd imiwnedd, lle maent yn ymateb i rwymo ATP allgellog, signal difrod a ryddhawyd gan gelloedd sy'n marw mewn haint ac anaf. Mae rhwymo ATP i dderbynyddion P2X7 yn arwain at fewnlifiad calsiwm ac yn cychwyn rhaeadr signalau i lawr yr afon, gan arwain at ffurfio mandyllau mawr yn y bilen plasma, newidiadau mewn siâp celloedd, secretion protein, actifadu kinase a newidiadau mewn mynegiant genynnau. Mae swyddogaeth sianel ïonau a signalau i lawr yr afon yn cael eu rheoleiddio'n fawr gan barthau mewngellog 30 amino-asid N-derfynol a 240 o barthau mewngellog C-terfynol amino-asid y derbynnydd (NTD a CTD), o leiaf yn rhannol trwy ryngweithio â lipidau yn y bilen plasma, ond nid ydym yn gwybod fawr ddim am eu rhyngweithiadau â biomoleciwlau eraill, neu pa rannau ohonynt sy'n ymwneud â llwybrau signalau. Mae strwythur cryoEM y llygod mawr hyd llawn P2X7 yn dangos bod yr NTD a'r rhan N-derfynol sy'n gyfoethog o cystein o'r CTD (angor C-Cys) yn palmitoylated, gan angori'r parthau hyn i daflen fewnol y bilen plasma, a bod y rhan C-derfynol o'r CTD (balast) yn ffurfio parth globular sy'n cynnwys safleoedd rhwymo ar gyfer sinc dinuclear a GDP / GTP, gan godi cwestiynau diddorol am ei swyddogaeth bosibl. Mae gwaith diweddar yn awgrymu y gall y parth balast rwymo i galsiwm-calmodulin, ac y gallai hyn effeithio ar ei gydffurfiad.

Ffocws y prosiect hwn yw ymchwilio i rôl parthau mewngellog P2X7 mewn signalau i lawr yr afon, gan ddefnyddio cyfuniad o fodelu moleciwlaidd, mutagenesis wedi'i gyfeirio at y safle, mynegiant protein, puro protein, profion swyddogaethol ac astudiaethau strwythurol uniongyrchol. Bydd ffocws arbennig yn cael ei roi i ddeall rôl y parth balast wrth gysylltu â rhaeadrau signalau mewngellog.

2. Assay the function and antimicrobial activity of slipper limpet hemocyanin

Mae ymwrthedd gwrthficrobaidd (AMR) yn cyrraedd pwynt argyfwng, gydag amcangyfrifon diweddar yn awgrymu erbyn 2050, bydd 10 miliwn o bobl bob blwyddyn yn marw o haint gan pathogenau ag AMR. Er mwyn mynd i'r afael â'r argyfwng hwn, mae angen therapiwteg gwrthficrobaidd newydd ac offer diagnostig gwell. Gan y bydd gwledydd sy'n datblygu yn cael eu heffeithio'n anghymesur gan AMR, mae hefyd yn hanfodol bod y therapiwteg newydd hyn yn hawdd ac yn rhad yn cael eu cynhyrchu mewn swmp.

Mae hemocyanins yn broteinau cludo ocsigen sy'n bresennol yn hemolymph (gwaed) arthropodau a molysgiaid. Yn ogystal â'u rôl ffisiolegol arferol, mae hemocyanins molluscan yn ymwneud ag ymateb imiwnedd cynhenid y gwesteiwr. Mae difrod i hemocyanins trwy naill ai triniaeth protease neu ddadnaturiad rhannol yn arwain at weithgaredd phenoloxidase, sy'n bwysig yn synthesis y pigment gwrthficrobaidd melanin. Dangoswyd hefyd bod Proteolysis yn rhyddhau peptidau gyda gweithgaredd gwrthficrobaidd.

Yn ddiweddar, rydym wedi dechrau ymchwilio i strwythur a phriodweddau swyddogaethol hemocyanin newydd o'r limpet sliper (Crepidula fornicata) a allai fod yn ffynhonnell peptidau gwrthficrobaidd newydd; gall y peptidau hyn gynrychioli set newydd o offer ar gyfer mynd i'r afael â phroblem gynyddol AMR. Mae data rhagarweiniol diweddar yn dangos bod y protein hemocyanin hyd llawn, a pharatoad wedi'i drin â protease, yn dangos gweithgaredd gwrth-bioffilm yn erbyn Staphylococcus aureus.

Yn y prosiect hwn, rydym yn bwriadu archwilio'r gweithgaredd gwrthficrobaidd a gwrthffilmiau posibl hwn ymhellach. Gan ddefnyddio ystod o rywogaethau bacteriol a ffwngaidd sy'n bwysig yn glinigol a methodolegau in vitro ac in vivo (Galleria mellonella), byddwn yn archwilio sensitifrwydd cymunedau planctonig a bioffilm (rhywogaethau sengl a chymysg) i'r cyfansoddion hyn. Bydd gallu'r cyfansoddion i newid pathogenedd microbaidd a rhyngweithio yn synergaidd â gwrthfiotigau cyfredol hefyd yn cael ei archwilio. Bydd arbrofion hefyd yn cael eu perfformio i nodweddu priodweddau swyddogaethol hemocyanin limpet sliper yn llawn, meintioli rhwymo ocsigen, gweithgaredd ensym a pharatoadau wedi'u trin â protease ffracsiynol i ynysu unedau swyddogaethol sengl a pheptidau gweithredol.

Mae'r prosiect hwn yn gyfle gwych i fyfyriwr weithio tuag at ddatblygu gwrthfiotigau newydd, dysgu a chymhwyso technegau mewn biocemeg protein, profion rhwymo ensym a ligandau, profion sensitifrwydd gwrthficrobaidd, profion bioffilm a phrofion virulence.

Goruchwyliaeth gyfredol

April Talbot

Lloyd Allen

Alex Moger

Lurui Wan